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报告概述

本报告是欧洲SARS-CoV-2和人畜共患流感生物信息学外部质量评估（ESIB-EQA）的第二轮（2024年），旨在评估参与实验室在公共健康生物信息学方面的能力，包括对SARS-CoV-2和人畜共患流感病毒的共识序列生成、质量控制、聚类与分型、突变检测以及抗病毒药物耐药性预测。报告覆盖EU/EEA国家及西巴尔干地区，通过模拟数据集和标准化流程对实验室表现进行评测，并提供改进建议。对于希望了解欧洲病毒基因组监测能力现状及提升方向的公共卫生从业者和实验室人员具有重要参考价值。

报告的核心结论

共识序列生成中参考序列依赖问题普遍存在

许多实验室在生成共识序列时过度依赖全局参考序列（如Wuhan-1），导致在引物区域和非扩增区域出现错误核苷酸或插入缺失。这一问题在流感病毒分析中更为突出，部分实验室仅使用编码序列参考而遗漏了非编码区核苷酸，或者未正确屏蔽引物序列，影响了序列完整性。

聚类分析中插入缺失（indels）常被忽略

在SARS-CoV-2聚类判定中，约65%的实验室未考虑插入缺失事件，仅依据单核苷酸变异（SNP）进行距离计算，导致错误聚类。此外，少数实验室使用了过大的聚类阈值（3个突变以上），进一步降低了判定准确性。报告建议将indels纳入系统发育距离计算。

流感病毒突变检测和耐药预测面临挑战

由于缺乏标准化的重要突变数据集，实验室对流感病毒中与毒力、宿主适应及耐药相关的突变检测率较低（仅31.8%的重要突变被检出）。对于抗病毒药物耐药性预测，奥司他韦耐药性正确报告率仅为38.9%，主要问题在于未检测到低频变异（minor variants）以及错误解读耐药标志物（如将PA:I38M用于H7N9亚型）。

参与率EU/EEA较高但西巴尔干地区为零

全部30个EU/EEA国家中有25国参与，参与度良好；然而西巴尔干六国和土耳其均未参与，表明该地区在基因组监测能力建设方面存在缺口。约三分之二的实验室同时参与了第一轮EQA，显示出持续改进的意愿。

SARS-CoV-2突变检测表现良好

在SARS4组件中，实验室对S基因氨基酸替代的检测正确率高达98.8%，仅出现2例错误。这一结果与第一轮EQA一致，表明参与实验室在SARS-CoV-2突变检出方面已具备较高能力，但该组件未来计划转换为抗病毒耐药性预测。

报告回答的关键问题

欧洲实验室在SARS-CoV-2生物信息学分析中有哪些常见错误？

报告指出，常见错误包括：在共识序列生成中依赖全局参考序列导致引物区域和非扩增区出现错误；质量控制时未识别共感染样本；聚类时忽略插入缺失；以及未使用最新版Pangolin软件进行谱系分类。这些问题会影响后续流行病学分析和公共卫生决策的准确性。

实验室在预测流感病毒抗病毒药物耐药性时面临哪些困难？

主要困难包括：低频变异的检测不足（60.9%的实验室未报告任何低频耐药突变），以及对耐药标志物的误解（如将仅见于季节性流感的PA:I38M用于H7N9亚型）。此外，流感病毒参考数据集不完整且缺乏标准化，导致部分实验室使用了错误的参考序列（如用H5N1参考处理H5N6样本）。

ECDC对改进实验室生物信息学能力提出了哪些建议？

报告提出13条具体建议，涵盖共识序列生成、质量控制、聚类和分类等方面。关键建议包括：避免在共识序列中引入非原始数据的indels，正确屏蔽引物序列，使用完整参考基因组（包含非编码区），对低质量样本进行手动审核，以及定期更新分类软件和参考数据集。

2024年欧洲实验室在流感病毒聚类分析中的表现如何？

在INFL3组件中，仅74%的序列被正确分配至相应聚类。主要原因包括：实验室对聚类阈值的定义不一致，部分基于进化枝而非突变计数进行判断，以及重建的共识序列质量差导致无法正确比较。报告建议制定更明确的聚类分析指南，并在分析中考虑插入缺失。

报告中的代表性数据

25/30

实验室参与率

2024，30个EU/EEA国家中有25国参与本次EQA，西巴尔干国家和土耳其未参与。

73%

SARS-CoV-2共识序列生成中关键差异比例

2024，在SARS1组件中，73%的插入差异发生在与全局参考序列插人间一位点，表明过度依赖参考序列是主要问题。

31.8%

流感病毒重要突变检出率

2024，在所有实验室对流感病毒重要突变（与毒力、宿主适应相关）的检测中，仅31.8%被正确报告，显示了检测能力的不足。

以上数据根据报告摘要整理，具体统计口径和数值请以完整报告原文为准。

完整报告包含什么

  • 完整参与实验室列表：包括来自25个EU/EEA国家的28个实验室的具体名称和所属机构。
  • 数据集详细组成：SARS1、SARS2、SARS3、SARS4以及流感组件INFL1-4的模拟样本描述，包括每个样本的病毒类型、挑战性特征（如共感染、重组、引物变更）及教育目的说明。
  • 方法学细节：共识序列生成流程（严格与宽松阈值）、质量控制判定标准、聚类和分类所用的软件版本及参数（如Pangolin、IQ-TREE、Nextstrain等）。
  • 流行病学情景建模：流感组件中四个虚拟爆发情景（家庭、禽鸟收藏者、农场、兽医）及其样本关联性分析，用于测试实验室的流行病学推理能力。
  • 错误分类原因分析：对SARS-CoV-2和流感病毒聚类/分型错误的具体原因进行归类统计，包括未考虑indels、使用过时软件、序列质量差等。
  • 抗病毒耐药性预测标准：基于WHO指南的耐药突变列表（包括奥司他韦、扎那米韦、巴洛沙韦、金刚烷胺）以及实验室报告与参考值的对比数据。
  • 反馈与改进措施：参与实验室对EQA组织满意度的问卷调查结果，以及第一轮EQA反馈后实施的改进（如允许Fasta格式提交、调整命名规则等）。
  • 推荐措施清单：针对个人实验室和ECDC的13条具体建议，每条附带目标受众、相关流程、描述及是否在第一轮中已提出。

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