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报告概述

本报告是ECDC发布的实验室手册更新版，聚焦百日咳鲍特菌的检测、鉴定和分型。报告系统介绍了从鼻咽采样、培养、PCR到血清学的诊断方法，并强调了不同病程阶段的适用选择。在分子监测方面，手册详细描述了抗原基因分型（MAST）、全基因组测序（WGS）及大环内酯类耐药快速检测方案，同时提供了疫苗抗原表达分析和抗菌药物敏感性试验的标准化流程。报告旨在帮助各国参考实验室建立可比性的数据体系，评估疫苗接种策略效果，并应对病原体进化带来的挑战。

报告的核心结论

标准化诊断方法对百日咳监测至关重要

报告指出，欧洲各国百日咳实验室诊断方法高度异质，导致发病率数据难以比较。为此，手册推荐统一使用抗PT IgG血清学（以IU/mL定量）、多靶点PCR组合（IS481+ptxP）及规范的培养流程，并强调采样时机与样本类型的关键影响。

大环内酯类耐药菌株全球蔓延需加强监测

自2024年起，欧洲多地检出大环内酯类耐药百日咳鲍特菌（MRBP），与中国流行的ptxP3克隆高度同源。手册新增了基于Etest、等位基因特异性PCR及实时PCR的耐药检测方案，并呼吁在临床和参考实验室建立快速识别能力。

全基因组测序正成为分子监测的主流方法

传统分型方法如MLVA和PFGE因分辨率不足逐渐被取代。WGS提供高分辨率SNP和基因-by-基因分析，结合BIGSdb-Pasteur数据库可实现欧洲范围内数据比对。手册详述了从DNA提取到数据分析的全流程，并指出长读长测序在解决重复序列组装难题中的优势。

疫苗抗原pertactin缺陷株流行趋势出现变化

COVID-19疫情后，PRN缺陷菌株比例在2023–2024年疫情中显著下降，可能由于PRN阳性株的再输入或群体免疫选择压力改变。但鉴于ACV免疫小鼠模型中PRN缺陷株具有更高适应度，持续监测其表达状态对疫苗策略调整意义重大。

报告回答的关键问题

如何正确诊断不同病程的百日咳？

病程<3周时，首选鼻咽拭子或抽吸物进行培养和PCR；病程>2–3周时，血清学检测抗PT IgG抗体更为有效，推荐单次样本≥100 IU/mL或双份样本显著变化作为诊断依据。报告还强调，PCR应联合IS481和ptxP靶点以提高特异性，并注意多病原面板可能降低灵敏度。

大环内酯类耐药百日咳鲍特菌如何检测？

检测方法包括：培养后Etest测定MIC（敏感<0.25 μg/mL，耐药>64 μg/mL）；等位基因特异性PCR检测23S rRNA A2047G突变；实时PCR终点基因分型法。报告提供了完整的protocol，并建议对Ct值≤32的PCR阳性样本优先进行耐药筛查。

全基因组测序在百日咳监测中有哪些应用？

WGS可用于高分辨率分型（cgMLST、SNP分析）、疫苗抗原基因变异检测、耐药突变鉴定及传播链追踪。报告推荐通过BIGSdb-Pasteur数据库进行基因分型，并指出长读长测序可完整解析含大量IS481重复序列的基因组，但培养阴性时可尝试培养无关的扩增子测序。

为什么会持续监测pertactin抗原表达？

Pertactin是无细胞百日咳疫苗的关键抗原。自ACV广泛使用后，PRN缺陷株在全球多地上升，但COVID-19疫情后其比例下降。监测PRN表达有助于评估疫苗选择压力对病原体进化的影响，并为疫苗组分更新提供依据。报告提供了ELISA和测序两种表型/基因型检测方法。

报告中的代表性数据

约210,000例

2024年EU/EEA百日咳报告病例数

2024年，由29个EU/EEA国家报告，为过去十年最高水平，反映疫情大幅回升。

941,565例

2024年全球百日咳报告病例数

2024年，WHO数据，是2000年以来最高，约为2023年及2019年病例数的6倍。

60%–92%

中国部分地区MRBP菌株比例

2013–2017年（北京、浙江、上海），多中心研究显示大环内酯类耐药菌株已近乎占据主导，且与ptxP3克隆相关。

以上数据根据报告摘要整理，具体统计口径和数值请以完整报告原文为准。

完整报告包含什么

  • 详细的鼻咽拭子和抽吸物采样操作规范，包括正确部位、运输条件及保存方法，并附有教学视频链接。
  • 培养与分离方案：使用Regan-Lowe或Bordet-Gengou培养基，加入头孢氨苄抑制杂菌，培养7天并每日观察典型菌落。
  • 实时定量PCR（qPCR）多重检测策略：推荐组合IS481/IS1001、ptxP和h-IS1001靶点以提高敏感性与特异性，并强调了避免使用棉签和藻酸钙拭子。
  • 血清学检测指导：仅以纯化PT包被的ELISA或多重免疫分析法检测抗PT IgG，结果以IU/mL表达，并提供60–75 IU/mL作为近期感染的单次cut-off建议。
  • 脉冲场凝胶电泳（PFGE）和MLVA的简要说明：虽然已被WGS取代，但仍为希望继续使用的实验室提供参考方案。
  • 全基因组测序（WGS）完整流程：从DNA提取质量要求（260/280≈1.8，260/230=2.0–2.2）、短读长与长读长平台比较，到BIGSdb-Pasteur数据库的cgMLST和SNP分析。
  • 大环内酯类耐药检测Protocol：包含Etest MIC测定（无EUCAST标准）、等位基因特异性PCR（A2047G突变）及LightCycler 480实时PCR终点基因分型法的详细操作步骤和质控。
  • 疫苗抗原表达分析ELISA方案：使用单克隆抗体检测PT、FHA、PRN和Fim抗原，并提供prn基因全长测序引物，用于鉴定表达缺陷株。

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